rtalabs DIAGNOVITAL®2019-NCOV

使用說明
1） 預期用途
本文介紹了實時RT-PCR檢測在體外定性檢測中的應用
2019年呼吸道標本和血清中的新型冠狀病毒（2019 nCoV）。2019 nCoV引物和探針組設計用于2019 nCoV的特定檢測。
這些試劑盒遵循疾控中心和世衛組織的新檢測指南。
2） DIAGNOVITAL®檢測
DIAGNOVITAL®2019-NCOV是基于RT-PCR的2019武漢冠狀病毒（2019-NCOV）實時檢測系統。2019年nCoV被認為是一種新的人類冠狀病毒，與引起季節性急性呼吸系統疾病的常見人類冠狀病毒（229E，NL63，OC43，HKU1）有著明顯的遺傳差異。它在基因上也不同于兩個新人類
冠狀病毒、MERS-CoV和SARS-CoV。

DIAGNOVITAL®2019-NCOV檢測到2019年NCOV存在3個不同且高度特異的基因序列：E基因、N基因和RdRP基因。所有3項化驗必須檢測為陽性，以確認樣本為2019 nCoV陽性。
此外，還包括非感染性陽性對照和陰性人類提取對照。陽性對照用于確認分析的功能和總體PCR性能，陰性人類提取對照用于評估獨立于2019年nCoV分析的RNA分離質量。

2.1）基于QPCR的2019-NCOV檢測
檢測2019株nCoV的一步是將病毒RNA轉化為cDNA。之后，通過熒光標記探針，對2019年nCoV*的目標序列進行實時放大監測：當加入新擴增的DNA鏈時，熒光團（FAM™) 被釋放，可以觀察到熒光信號的增加。
由于冠狀病毒的固有突變率，目標序列中的突變有可能隨著時間的推移而發生和積累。這可能導致基于PCR的檢測方法出現假陰性結果。DIAGNOVITAL®2019-NCOV通過對3個不同的目標序列使用3種檢測分析來解決此問題，以大限度地減少由改變的目標序列導致假陰性結果的機會。
如果樣品在一個或多個分析中檢測為陰性，則可能需要額外的補充檢測。2019年nCoV的原始靶序列作為非感染性靶陽性對照（TPC）包括在內，以檢查檢測分析的完整性。
應始終通過補充方法和獨立實驗室中的附加分析來確認檢測呈陽性的樣品。

PRODUCT SIZE SKU

DIAGNOVITAL®2019-NCOV

50 rxn / 20 µl PCC

SKU15259

2.2) MATERIALS PROVIDED

QUANTITY AND VOLUME COMPONENT

2.3）所需附加材料
•核酸提取的適當方法和設備（見第3.4章）
•為FAM配備實時PCR檢測系統™ 偵查
•可調移液管和安裝過濾移液管頭
•適當的PSA和工作區，用于處理潛在感染性樣本
•表面去污劑，如DNAZap™ （生命科技），遠離DNA™ （費舍爾科學），離開™ （Fisher Scientific），10%漂白劑（市售5.25-6.0%次氯酸鈉的1:10稀釋度）
•無核酸酶管/條/板，用于制備稀釋液、主混合物等；與PCR裝置相對應的無核酸酶管/條/板
•試劑和樣品的適當儲存選擇（4℃、-20℃、-70℃）

2.4）儲存
•將所有部件儲存在-20°C下，避免重復凍融循環。•保護2X qPCR主混合料不受光照，因為長時間曝光會降低熒光粉的性能。

3） 開始前的注意事項
3.1）生物安全•穿戴適當的個人防護裝備（如長袍、無粉手套，
當使用臨床樣本時。•應按照生物安全2級或更高級別的指南，在經認證的二級生物安全柜中進行樣本處理。

3.2）試樣
僅使用適當的樣本進行測試，例如：•呼吸樣本，包括鼻咽/口咽抽吸物或沖洗液、鼻咽/口咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物和痰。•拭子樣本只能在帶有合成的拭子上采集（例如
聚酯或滌綸（帶鋁或塑料軸）。不接受含有海藻酸鈣的棉簽或帶有木軸的棉簽
3.3）試樣-搬運和儲存
•采集后，樣品可在4°C下保存72小時。
•如果預計提取會延遲，則將樣品儲存在-70°C或更低的溫度下。
•提取的核酸應儲存在-70°C或更低的溫度下。
如果
•未將其保存在2-4°C（≤4天）或在-70°C或更低溫度下冷凍。
•標簽不足或缺乏文件。
•它們不適用于此目的（有關合適的樣品材料，見上文）。
•樣本容量不足。

3.4）樣品制備/核酸提取：RT-PCR檢測的性能很大程度上取決于樣品模板RNA的量和質量。強烈建議在測試樣本之前，對回收和純度的RNA提取程序進行鑒定和驗證。•與DIAGNOVITAL®檢測試劑盒成功結合使用的合適核酸提取系統包括：bioMérieux NucliSens®系統、QIAamp®病毒RNA小試劑盒、QIAamp®Minelote病毒自旋試劑盒或RNeasy®小試劑盒（QIAGEN）、EZ1 DSP病毒試劑盒（QIAGEN）、Roche MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒、Roche MagNA Pure
緊湊型核酸分離試劑盒、羅氏麥格納純96 DNA和病毒核酸小容量試劑盒、Invitrogen ChargeSwitch®總RNA細胞試劑盒。
•將剩余樣本和提取的核酸保存在-70°C下。•僅解凍一天內要測試的樣本提取物數量。

•測試前不要冷凍/解凍提取物超過一次，因為每次冷凍/解凍循環都會降低RNA質量。•根據樣本類型，可以直接使用患者樣本。
然而，這可能需要預先的溶解步驟和滴定樣品上的量，可以在不抑制反應的情況下使用。此過程尚未驗證，請使用
建議分離RNA。
3.5）反應裝置
1） 在開始實驗之前，確保所有必要的設備和裝置都是合適的、校準的和功能正常的。
2） 對設備和工作區進行凈化，并準備好以下實驗所需的一切，以保持工作流程的簡短和可重復性。
3） 打開PCR檢測系統并對其進行編程，以避免在設置反應后出現延遲。
4） 在冰上解凍DIAGNOVITAL®2019-NCOV的所有成分，并輕輕但*地混合，以確保成分均勻分布?？焖傩D收集管底部的液體。
5） 對于一個測試，準備一系列的RNA稀釋來確定理想的濃度窗口。建議的樣品體積小于終反應體積的10%。
6） 設置Mastermix板：

a、 務*無核酸酶的二氧化二氫（dH2O）代替樣品材料（NTC）制備對照反應，以檢測試劑中的污染。
b、 始終包括陰性人類提取控制（HEC）的分析，以評估您的RNA分離物的質量。
c、 當使用提供的靶陽性對照品（TPC）時，使用1微升/反應，并將無核酸酶的dH2O添加到20微升。
d、 強烈推薦2份以上的復制品/樣品。
e、 為所有計劃的反應準備足夠的混料。建議為2個附加反應制備mastermix，以補償移液誤差。
f、 將混合料分發到板條/盤子中。示例設置如圖1所示。

OMPONENT VOLUME

50X DIAGNOVITAL®Reverse Transcriptase 0.4 µl

DIAGNOVITAL®2X qPCR Mastermix (E / N / RdRP / HEC) 10 µl

isolated sample RNA / TPC X µl / 1 µl

Nuclease-free dH2O to 20 µl

7） 將Mastermix板轉移到單獨的工作區以添加樣品材料。
在單獨的工作區準備試劑和終反應裝置有助于避免設備和試劑與樣品材料的污染。
a、 在處理陽性樣品之前，先準備好陰性反應并密封。建議在制備和密封NTC后，僅將潛在陽性樣品材料和包含的目標陽性對照品帶到工作區。
b、 將您的樣品添加到Mastermix板中。示例設置如圖2所示。