Mediomics’Bridge It®S-腺苷甲硫氨酸（SAM）熒光分析說(shuō)明書

介紹

*Bridge It®S-腺苷甲硫氨酸（SAM）熒光分析試劑盒僅用于實(shí)驗(yàn)室研究和開(kāi)發(fā)（研發(fā)）目的。本產(chǎn)品未經(jīng)政府監(jiān)管部門批準(zhǔn)用于人類或動(dòng)物疾病的診斷或治療、食品監(jiān)測(cè)或?qū)嶒?yàn)室研發(fā)以外的任何應(yīng)用，不得用于此類目的。

S-腺苷甲硫氨酸（也稱為SAM，SAMe或AdoMet）在所有類型生物體的甲基化生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在甲基化循環(huán)中，SAM充當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)共價(jià)修飾中使用的甲基基團(tuán)的供體。SAM水平的可變性與衰老過(guò)程、許多神經(jīng)和精神疾病（包括阿爾茨海默病、抑郁癥、HIV相關(guān)疾病）有關(guān)

神經(jīng)功能障礙/癡呆、多發(fā)性硬化、帕金森病、脊髓變性、癲癇、纖維肌痛、偏頭痛，以及慢性肝功能障礙、動(dòng)脈硬化和癌癥。目前，使用高壓液相色譜法（HPLC）對(duì)SAM進(jìn)行定量。高效液相色譜法耗時(shí)、成本高，而且由于需要大量有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境不友好。

所有序列特異性DNA結(jié)合蛋白的共同特性是，它們能夠以高親和力和特異性結(jié)合到包含*核苷酸序列的DNA雙鏈，即蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點(diǎn)。Mediomics的新型分析平臺(tái)設(shè)計(jì)依賴于這一共同特征。包含給定目標(biāo)DNA結(jié)合蛋白的序列特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)的DNA雙鏈體被拆分為兩個(gè)DNA“半位點(diǎn)"雙鏈體，每個(gè)雙鏈體具有短的單鏈上臂。這些單鏈延伸足夠短，因此在缺乏靶蛋白的情況下幾乎不會(huì)發(fā)生自發(fā)的重新結(jié)合。

然而，當(dāng)存在靶蛋白時(shí)，其對(duì)全長(zhǎng)DNA序列的高親和力將驅(qū)動(dòng)兩個(gè)半位點(diǎn)DNA雙鏈體的重新結(jié)合。通過(guò)在兩個(gè)DNA半位點(diǎn)中的每一個(gè)結(jié)合適當(dāng)?shù)臒晒馓结槪梢造`敏地檢測(cè)到這種重新結(jié)合。DNA結(jié)合蛋白的存在被檢測(cè)為熒光信號(hào)的增加。如下圖所示，這種基本平臺(tái)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單變體允許DNA結(jié)合蛋白（黃色卵形）作為其特定配體的敏感生物傳感器發(fā)揮作用：

真核細(xì)胞大約含有3000個(gè)序列特異性DNA結(jié)合蛋白。這些重要的蛋白質(zhì)在有或沒(méi)有特定小分子協(xié)同調(diào)節(jié)器（配體）的情況下發(fā)揮作用，控制基因組DNA活動(dòng)的各個(gè)方面，包括基因表達(dá)、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)。Mediomics正在應(yīng)用其新型熒光分析平臺(tái)開(kāi)發(fā)體外分析，用于快速、靈敏地定量DNA結(jié)合蛋白及其小分子配體的活性。S-腺苷甲硫氨酸是一種小分子配體，與甲硫氨酸阻遏蛋白結(jié)合并共同調(diào)節(jié)其活性。

Mediomics Bridge It®SAM熒光分析方法基于成熟的熒光測(cè)量技術(shù)和新的分析平臺(tái)設(shè)計(jì)的組合，該平臺(tái)利用DNA結(jié)合蛋白作為其各自小分子co調(diào)節(jié)器（配體）的生物傳感器。DNA序列特異性MetJ甲硫氨酸阻遏蛋白對(duì)其*DNA結(jié)合位點(diǎn)的親和力在其配體S腺苷甲硫氨酸存在下大大增加。在本試驗(yàn)中，MetJ共有序列分為兩部分

大約相等的DNA“半位點(diǎn)"，其中一半片段用熒光素標(biāo)記，另一半片段用Oyster®645熒光團(tuán)標(biāo)記。測(cè)試樣本中SAM的相對(duì)含量將影響分析中DNA-MetJ蛋白復(fù)合物的形成量。當(dāng)這種復(fù)合物形成時(shí)，它使熒光標(biāo)記的DNA半位點(diǎn)非常接近，并引起熒光信號(hào)發(fā)射的可測(cè)量變化（增加），可使用微孔板讀取器輕松測(cè)量（波長(zhǎng)設(shè)置：

吸收485 nm；發(fā)射665 nm）。然后使用SAM標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測(cè)試樣品中的SAM濃度。

Bridge It®SAM熒光分析方法具有非常理想的性能特征，包括高（>6:1）信號(hào)背景比、良好的檢測(cè)范圍（~ 0.4μM–100μM）和~ 0.4μM的檢測(cè)靈敏度。該檢測(cè)水平（~ 0.4μM）有助于在大多數(shù)感興趣的測(cè)試樣本（包括生物流體）中量化SAM，細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基，以及組織和細(xì)胞提取物。該測(cè)定可以修改為任何使用SAM作為反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶反應(yīng)的測(cè)定。

分析試劑盒中包含的試劑量足以使用黑色384孔非結(jié)合表面微孔板執(zhí)行數(shù)量的單個(gè)SAM測(cè)量。將SAM分析溶液儲(chǔ)存在-80°C下直至使用，在該溫度下其活性可保持長(zhǎng)達(dá)1年。如果-80°C冷凍柜不可用，則將SAM分析溶液儲(chǔ)存在-20°C下，直到使用為止，其活性將保持長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。Bridge It®SAM熒光分析試劑盒的其余部分可在-20oC下儲(chǔ)存在冰箱中，直至需要時(shí)使用。僅解凍計(jì)劃實(shí)驗(yàn)所需的適當(dāng)數(shù)量的試劑管。每管SAM分析溶液包含足以使用384孔黑色微孔板進(jìn)行五十（50）次SAM測(cè)量的試劑。將SAM分析溶液在37℃下解凍30分鐘，并在室溫下保存，直至使用。任何未使用的試劑可在4°C的冰箱中密閉存放一周。SAM檢測(cè)試劑盒

試劑在-20°C下儲(chǔ)存時(shí)將保持其活性至少2個(gè)月。